磺胺类试剂盒

【原理】

本试剂盒采用间接竞争ELISA方法，在微孔条上预包被偶联抗原，样本中的残留物磺胺嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺甲噁唑、磺胺甲基嘧啶、酞酰磺噻唑、磺胺甲噻二唑、磺胺对甲氧嘧啶、磺胺异噁唑、磺胺二甲基嘧啶、磺胺间二甲氧嘧啶、磺胺多辛、磺胺喹噁啉、磺胺甲氧哒嗪、磺胺氯哒嗪、磺胺苯酰与微孔条上预包被的偶联抗原竞争抗磺胺的抗体，加入酶标记物后，用TMB底物显色，样本吸光值与其所含磺胺类药物的含量成负相关，与标准曲线比较即可得出残留物磺胺类药物的含量。

【试剂盒技术指标】  

规      格：96孔/盒

灵 敏 度：0.2ppb

检测时间： 45min

样本检测下限：

组 织 （高检测限方法）……………………………0.2ppb

组 织 （低检测限方法）……………………………1ppb

 蜂 蜜…………………………………………………0.2ppb

血 清 、 尿 液  ………………………………………0.8ppb

牛  奶………………………………………………  4ppb

样本回收率：

组  织 、 蜂 蜜 ………………………………  85% ±25%

尿样、牛奶、血清…………………………  70% ±20%

 交 叉 率 ：

磺胺嘧啶（SD或SDZ）……………………………100 %

磺胺甲基嘧啶（SM1 ）…………………………… 82%

磺胺二甲基嘧啶（SM2）  ………………………… 121%

    由交叉率可以得出：该试剂盒可用于磺胺多种残留物的检测，完全满足国家磺胺类多残留种类检测的要求。

【试剂盒组成】  

1．   微量测试孔：每条8孔，一板12条

2．   标 准 液×6瓶：（1ml/瓶） 0ppb、0.2ppb、0.6pb、 1.8ppb、5.4ppb、16.2ppb

3．   酶标记物     7ml ………………………  红色帽

4．   抗体工作液 7ml ………………………  绿色帽

5．   底物A液    7ml …………………………白色帽

6．   底物B液　 7 ml …………………………黑色帽

7．   终止液     7 ml …..……………………  黄色帽

8．   20X浓缩洗涤液40 ml ………………… 透明帽

9．   2X浓缩复溶液 50 ml …………………  蓝色帽

【所用仪器、试剂】  

具备的仪器：微孔酶标仪、打印机、均质器 、氮气吹干装置、振荡器、离心机、刻度移液管、天平（感量0.01g）

微量移液器：单道20μl-200μl，100μl-1000μl、多道250μl

试 剂：乙酸乙酯、正己烷、Na₂HPO₄·12H₂O、NaOH NaH₂PO₄·2H₂O、浓HCL、二氯甲烷

【样本前处理步骤】  

样本前处理须知

      处理任何样本时，都必须注意：

（a）本试剂盒所检测的组织样本包括：动物组织、禽类和水产组织。eg:鸡、鸭、牛、兔、鱼、虾等。

（b）实验中必须使用一次性吸头，在吸取不同的试剂时要更换吸头。

（c）实验之前须检查各种实验器具是否干净，必要时可对实验器具进行清洁，以避免污染干扰实验结果。

样本前处理需配制：

配液1、0.2M NaOH溶液称取0.8gNaOH用去离子水100ml溶解。

配液2、0.5M盐酸溶液4.3ml浓HCL加入去离子水定容至100ml混匀。

配液3、0.02M PB缓冲液称取2.58g Na₂HPO₄·12H₂O和0.44g NaH₂PO₄·2H₂O加去离子水500ml溶解。

   配液 4、乙腈-二氯甲烷混合溶液V乙腈-V二氯甲烷  =  1 : 4

   配液5、样本复溶液：将2×浓缩复溶液用去离子水以1：1稀（1份浓缩复溶液+1份去离子水），用于样本提取后的复溶。

（a ）组织高检测限处理方法一：

1、称2.0±0.05g均质过的组织样本于50ml离心管中；加入乙腈-二氯甲烷混合溶液8ml，振荡2min，4000r/min以上，15℃离心10min；

2、取4ml上层清澈有机相至干燥溶器中，56℃氮气吹干/旋转蒸发至干；

3、用1ml稀释后的复溶液溶解干燥的残留物，加入正己烷1ml混合30s，4000r/min以上，15℃离心5min；

5、去除上层取下层50μl液体用于分析

      样本稀释倍数：1倍

（b）组织高检测限处理方法二：

1、称取3±0.05g匀浆物置离心管中，先加入3ml0.02M  PB缓冲液充分振荡混匀，再加入4ml乙酸乙酯和2ml乙腈，充分振荡10min，于15℃，4000r/min以上速度离心10min；

2、移取2ml上层液体（约相当于1g的样本）在50-60℃氮气或空气吹干；

3、加入1ml正己烷溶解干燥的残留物，再加入1ml稀释后的复溶液强烈振荡1min，室温4000r/min，离心5min，除去上层液；

4、取50μl下层用于分析。

样本稀释倍数：1倍

注：在使用国家规定最高残留限量（100ppb）进行判定时，需进行5倍稀释（1份样本液+4份已稀释好的复溶液）。

（c） 组织低检测限处理方法

1、称取2.0±0.05g均质过的组织样本于50ml离心管中；加入8ml0.02M  PB缓冲液，充分振荡2min，于15℃，4000r/min以上速度离心10min

2、取50μl液体用于分析。

样本稀释倍数：5倍

（d） 血清样本

1、将血样本于室温放置30min，于10℃，4000r/min以上离心10min，分离出血清或过滤血清；

2、   取1ml血清，加入3ml 0.02 M PB缓冲液混合，混合30s；

3、   取50μl液体用于分析。

   样本稀释倍数：4倍　　

（e）蜂蜜

1、 称取1±0.05g蜂蜜样本于50ml离心管中，加入1ml0.5M盐酸置于37℃环境中30min；

2、   加入2.5ml 0.2M 氢氧化钠 (将PH值调至5左右)再加入4ml乙酸乙脂振荡5min，4000r/min以上室温离心10min；

3、   取2ml上层液体于50℃下氮气吹干，加0.5ml 已稀释好的复溶液复溶，混合30s；

4、   取50μl液体用于分析。

     样本稀释倍数：1倍

（f）尿液

1、 用3ml0.02 MPB缓冲液与1ml经离心后的清亮尿样本混合，混合30s；

2、   取50μl液体用于分析。

    样本稀释倍数：4倍　　　

（g）牛奶

1、取1ml牛奶样本用0.02 MPB缓冲液按1︰19（v/v）稀释（即20μl牛奶+380μl0.02  MPB缓冲液），混合30s；

2、取50μl液体用于分析。

     样本稀释倍数：20倍     

【酶标免疫分析程序】  

测定前应须知：

1、使用之前将所有试剂和需用板条的温度回升至室温（20-25℃）。

2、使用之后立即将所有试剂放回2-8℃环境。

3、在ELISA分析中的再现性，很大程度上取决于洗板的一致性，正确的洗板操作是ELISA测定程序中的要点。

4、在所有恒温孵育过程中，避免光线照射，用盖板膜封住微孔板。

操作步骤：

1、   将所需试剂从冷藏环境中取出，置室温（20-25℃）平衡30min以上，注意每种液体试剂使用前均须摇匀。

2、   按板架及需要取出微孔条，将不用的微孔放入自封袋，保存于2-8℃。

3、  配液：将40ml浓缩洗涤液（20倍浓缩）用去离子水按照1：19稀释（1份浓缩洗涤液+19份去离子水），或按所需用量配制洗涤液。

4、  编号：将样本和标准品对应微孔按序编号每个样本和标准品做2孔平行，并记录标准孔和样本孔所在的位置。

5、   加标准品/样本50μl /孔，然后加酶标记物50μl/孔，再加入抗体工作液50μl/孔。轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板，25℃环境反应30min。

6、   取出用洗涤液按每孔250μl洗板4-5次，每次浸泡15-30秒，拍干（拍干后未被清除的气泡可用干净的枪头刺破）。

7、   显色：每孔加入底物液A液50μl再加B液50μl，轻轻振荡混匀，25℃环境避光显色15min。

8、   测定：每孔加入终止液50μl，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450nm处（建议用双波长450/630nm检测在5min内读完数据），测定吸光度值（OD值）。

【结果判定】  

         结果判定有两种方法，粗略判定可用第1种方法，定量判定用第2种方法。注意样本吸光值与磺胺类药物的含量成负相关。

1、粗略判定

用样本的平均吸光度值与标准值比较即可得出其浓度范围(ng /ml)。假设样本1的吸光度值为0.221，样本2的吸光度值为0.795，标准液吸光度值分别是：0ppb为1.81；0.2ppb为1.50；0.6ppb为1.114；1.8ppb为0.660； 5.4ppb为0.318；16.2ppb为0.145。则样本1的浓度范围是5.4ppb-16.2ppb；样本2的浓度范围是0.6ppb-1.8ppb。乘以其对应的稀释倍数即为样本中磺胺类药物实际含量。

2、定量分析

（1）百分吸光率的计算，标准品或样本的百分吸光率等于标准品或样本的百分吸光度值的平均值（双孔）除以第一个标准（0标准）的吸光度值，再乘以100%，即：

B—标准溶液或样本溶液的平均吸光度值

B₀—0ng/ml标准溶液的平均吸光度值

（2）标准曲线的绘制与计算

以标准品百分吸光率为纵坐标，以磺胺类药物浓度（ng /ml）的半对数为横坐标，绘制标准曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中磺胺类药物实际含量。

若利用试剂盒专业分析软件进行计算，更便于大量样本的准确、快速分析。（欢迎来电索取）

3、标准曲线：

B/B0 (%)

 

        0.2            0.6              1.8               5.4          16.2

 (ppb) [μg/kg]

图1：磺胺类药物检测试剂盒的回归曲线

4、再现性：

%CV

         

         0      0.2        0.6          1.8       5.4       16.2

(ppb) [μg/kg]

图2：磺胺类药物检测试剂盒的精密度

由多个不同的实验结果确定了精密度，图2显示出磺胺类药检测试剂盒的精密度情况，获得的标准吸收值的变异系数（%CV）对相应磺胺类药浓度作曲线，可以看到在全部范围内变异系数如此之低，可以得到很好的再现性。

【注意事项】  

1、    使用前将所有试剂温度回升至室温20-25℃。试剂及标本没有回到室温（20-25℃）会导致所有标准的OD值偏低。

2、    在洗板过程中如果出现板孔干燥的情况，则会伴随着出现标准曲线不成线性，重复性不好的现象。所以洗板拍干后应立即进行下一步操作。

3、    混合要均匀，否则会出现重复性不好的现象。

4、    反应终止液为2M硫酸，避免接触皮肤。

5、    不要使用过了有效日期的试剂盒，稀释或搀杂使用会引起灵敏度、OD值的变化。不要交换使用不同批号的盒中试剂。

6、    不用的微孔板放进自封袋密封；标准物质和无色的发色剂对光敏感，因此要避免直接暴露在光线下。

7、    显色液若有任何颜色表明变质，应当弃之。0标准的吸光度值小于0.5个单位（A_450nm< 0.5 ）时，表示试剂可能变质。

8、    该试剂盒最佳反应温度为25℃，温度过高或过低将导致检测吸光度值和灵敏度发生变化。

【储存】

 原包装应储存于2～8℃保鲜冷藏，切勿冷冻。

【有效期】

 有效期12个月;生产日期、有效期、生产批号见外包装。